Details

Autor(en) / Beteiligte

• Szilárd, Kovács

Titel

Új Medicago Truncatula Szimbiotikus Gének Azonosítása és Jellemzése és az NSP2 gén két Pontmutáns Alléljának Funkcionális Analízise

Ort / Verlag

ProQuest Dissertations & Theses

Erscheinungsjahr

2022

Link zum Volltext

• ProQuest

Quelle

ProQuest Dissertations & Theses A&I

Beschreibungen/Notizen

• A pillangósvirágú növények képesek nitrogénkötő szimbiotikus kapcsolat kialakítására talajlakó (rhizobium) baktériumokkal. A szimbionta baktériumok a növények gyökéren kialakuló új szervben, a gyökérgümőben végzik a légköri nitrogén redukálását, melyhez a szükséges energiát és életteret a növény biztosítja. Kutatócsoportunk fő célkitűzése a folyamatot irányító növényi gének azonosítása és azok funkcionális viszgálata. Doktori dolgozatomban új szimbiotikus mutáns vonalak és ezekben a mutációt szenvedett szimbiotikus gének azonosítását és funkcionális analízisét tárgyalom. Emellett disszertációmban az NSP2 (Nodulation Signaling Pathways 2) két pontmutáns alléljának összehasonlító fenotipusos és funkcionális analízisét mutatom be.Új szimbitotikus mutáns vonalak és gének azonosításaMunkánk során a pillangósvirágú modell növény, a M. truncatula egyik Tnt1 inszerciós mutánsgyűjteményét használtuk szimbiotikus gének azonosítására hagyományos klasszikus genetikai megközelítéssel és modern molekuláris technikák alkalmazásával. Munkánk során sikerült 7 szimbiotikus mutáns vonalat azonosítanunk, melyek rhizobium baktériummal történő fertőzést követően nem voltak képesek hatékony nitrogénkötő szimbiózis kialakítására. Újgenerációs szekvenálási módszerrel a 7 vonalban összesen 129 különböző inszerciós eseményt sikerült azonosítanunk. Az inszerciós események genomi pozíciójának analízise után 59 olyan jelölt gént választottunk ki, melyek nagy valószínűség szerint a vizsgált vonalakban megfigyelt mutáns fenotípust okozhatták. Az egyes vonalakban azonosított mutáns fenotípus és az inszerciós események ko-szegregációjának vizsgálatával a 7 vonal közül eddig kettőben sikerült azonosítanunk a fenotípussal ko-szegregáló inszerciós eseményt. Genetikai komplementációs kísérletekkel sikerült bizonyítanunk a két mutációt szenvedett gén szimbiotikus funkcióját.Az Infection-related Epidermal Factor (IEF) gén azonosítása és funkcionális jellemzéseAz egyik mutánsban a szimbiotikus kapcsolat már igen korai fázisban leáll. A rhizobium fertőzést követően a gyökérszőrgörbülés a mutánsban a vad típushoz hasonlóan végbemegy, azonban infekciós fonál fejlődése elakad, és soha nem jut tovább a gyökérszőrtől a mélyebb sejtrétegek felé. Ennek következtében a mutánsban a formálódó gyökérprimordium bakteriális inváziója nem történik meg. A mutációt szenvedett gén tehát a szimbiotikus interakció során az infekciós fonál fejlődéséhez szükséges. Kísérleteink során azonosítottuk a gént és funkciójának megerősítése céljából komplementációs kísérleteket végeztünk, melyekkel sikerült bizonyítanunk a mutációt szenvedett gén szimbiotikus funkcióját. Kimutattuk, hogy a gén a rhizobium baktériumok hatására vagy az általuk termelt NF jelmolekulák történő kezelést követően a szimbiózis nagyon korai szakaszán indukálódik az epidermisz sejtekben. Különböző, a szimbiotikus útvonal korai szakaszában hibás mutánsban vizsgáltuk a gén aktivitását és meghatároztuk a gén helyét NF szignál útvonalban. Megállapítottuk, hogy az általunk azonosított gén az NF jelátviteli útvonalon belül az ERN1 transzkripciós faktor után helyezkedik el. Kísérletesen bizonyítottuk, hogy a vizsgált gén funkciója nem szükséges a gümőfejlődés programjához, ellenben a bakteriális infekcióhoz nélkülözhetetlen. Az azonosított gén által kódolt fehérje a citoplazmában és a sejtmagban lokalizálódik. A vizsgált fehérje kölcsönhat a nitrogénkötő szimbiózis kialakításához szintén nélkülözhetetlen RPG fehérjével. Eredményeink alapján a gént IEF–nek (Infection-related Epidermal Factor) neveztük el.A Nodules with Activated Defense 1 (NAD1) gén új alléljának azonosítása és jellemzéseA másik vonalban a gén azonosítását követően kiderült, hogy a mutációt szenvedett gént a együttműködő partnerünk egy másik mutáns vonal segítségével már azonosította, így a két mutáns vonal jellemzéséből származó eredmények egy közös publikációban kerültek közlésre. Ebben a vonalban a baktérium lefűződését követően növényi védekezési reakciók indulnak be, ezért nem alakul ki a működő gümőre jellemző nitrogénkötő zóna és gümő struktúra. Bár a GFP fehérjével fuzióban lévő NAD1 fehérje nem volt képes komplementálni a M. truncatula mutáns fenotípusát, megállapítottuk, hogy a NAD1 endoplazmatikus lokalizációját N. benthamiana levél sejtekben. A mutációt szenvedett gén vizsgálatainkkal párhuzamosan publikálásra került, ezért a mutáns vonal a NAD1 gén új alléljának neveztük el.